Taq polymerase là gì

     

Thuật ngữ PCR là viết tắt của "Polymerase-Chain-Reaction", đây là một phản nghịch ứng nhân bạn dạng DNA dựa trên những chu kỳ nhiệt. Bài viết này nhằm ra mắt các thông tin đặc biệt quan trọng về chuyên môn PCR tương tự như các vấn đề thường chạm mặt khi sử dụng kỹ thuật này.

Bạn đang xem: Taq polymerase là gì

 

KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?

 

Thuật ngữ PCR duy nhất phản ứng nhân bạn dạng DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Phản ứng diễn ra trong một ống nghiệm nhỏ tuổi chứa hỗn hợp phản ứng (gọi là PCR mix). Trong PCR mix đang chứa những thành phần:

1) Polymerase độ chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này còn có nhiệt độ chuyển động tối ưu sinh sống 72 oC.2) 4 một số loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là vật liệu để tổng phù hợp ra các bạn dạng sao DNA.3) DNA chứa trình tự mục tiêu (Template): thông thường trong xét nghiệm thì đấy là DNA thu thừa nhận từ mẫu yêu cầu xét nghiệm.4) Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng tầm 20 nucleotide với bắt cặp bổ sung đặc hiệu mang đến 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản.5) Cation Mg2+ (MgCl2): đó là co-factor đặc biệt để Taq polymerase chuyển động hiệu quả.6) hỗn hợp đệm Tris-KCl (PCR Buffer): cung cấp môi trường thuận tiện cho bội phản ứng nhân phiên bản diễn ra.

 

Ống nghiệm chứa PCR mix sẽ được đặt vào trong phòng ủ của sản phẩm luân nhiệt (Thermo cycler), ở nước ta thì thường gọi luôn là trang bị PCR. Sức nóng độ phía bên trong buồng ủ của máy PCR sẽ đổi khác theo chu kỳ, nhờ này mà quá trình nhân phiên bản DNA được diễn ra (xem video).

 

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR

 

Một chu kỳ luân hồi nhiệt của PCR sẽ bao gồm 3 quy trình tiến độ nhiệt độ (Hình 1):

1 - tiến trình biến tính: sức nóng độ sẽ tiến hành đưa lên 94 oC, những liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị đổi thay tính phát triển thành dạng mạch đơn.

Xem thêm: Hướng Dẫn Cách Tắt Nguồn Iphone 8 Plus Khi Bị Đơ, Giật Máy Ngay Tại Nhà

2 - tiến độ bắt cặp: ánh sáng được hạ xuống 55 - 65 oC, những đoạn mồi vẫn bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình trường đoản cú mục tiêu.3 - giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được gửi lên 72 oC, Taq polymerase sẽ áp dụng dNTP để kéo dãn dài đầu 3" của mồi và tạo nên mạch xẻ sung.
*
Hình 1. Quy trình nhiệt của một các bước PCR

Như vậy, cứ qua 1 chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi. Nếu chu kỳ luân hồi nhiệt lặp lại liên tiếp 30 - 40 lần thì số phiên bản sao đang là 230 ~ 240 phiên bản sao. Số lượng bản sao DNA vĩ đại này lúc được gắn những phân tử phát tín hiệu (ví dụ Ethidium Bromide) hoàn toàn có thể nhìn thấy bởi mắt thường xuyên trên gel năng lượng điện di dưới ánh đèn UV (Hình 2).


1527453158292/Agarose-gel-electrophoresis-analysis-stained-with-ethidium-bromide-of-PCR-products.png" alt="*">
Hình 2. Ảnh chụp sản phẩm PCR (giếng 1~7) dưới ánh đèn sáng UVtrên gel agarose nhuộm bằng Ethidium Bromide

 

VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR

 

Nguyên lý của PCR là khuếch đại DNA, do vậy các phòng thí nghiệm áp dụng PCR liên tục không mau chóng thì muộn cũng trở thành bị nhiễm sản phẩm PCR lên toàn bộ các thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Người làm thí nghiệm sẽ phân biệt được thảm họa này khi tổng thể các lần chạy PCR đông đảo ra dương tính, tất cả khi sử dụng mẫu là nước cất. Khi điều đó xảy ra thì chỉ tất cả cách bỏ cục bộ hóa chất, khử nhiễm toàn bộ phòng thể nghiệm .... Mặc dù vậy vấn đề này vẫn sẽ tái diễn sau một khoảng thời gian sử dụng PCR.


*
Hình 3. Sơ đồ vật xử lý sản phẩm PCR ngoại nhiễm bởi UNG

Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức so với các phòng nghiên cứu sinh học phân tử. Mặc dù nhiên, hiện thời các nhà kỹ thuật đã rất có thể giải quyết sự việc này một biện pháp khá hữu dụng (Hình 3), chính là trong nguyên tố dNTP có bổ sung thêm một ít dUTP. Các sản phẩm PCR tạo ra sẽ luôn luôn tồn tại một trong những vị trí là U thay vày T, những vị trí U này sẽ rất có thể xử lý phân hủy bởi enzme UNG. Chủng loại DNA thu dấn từ mẫu thật (template) sẽ không chứa U, vì vậy ủ PCR phối với enzyme UNG trước khi PCR để giúp đỡ phân cắt toàn thể các DNA nước ngoài nhiễm nhưng mà không ảnh hưởng đến template.

 

CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP vào XÉT NGHIỆM

 

1) PCR đối chọi mồi (Simplex PCR): Đây là kiểu dáng PCR cổ xưa nhất, sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu nhằm khuếch đại 1 đoạn trình tự kim chỉ nam duy nhất.

2) PCR nhiều mồi (Multiplex PCR): Đây là phong cách PCR thực hiện nhiều cặp mồi không giống nhau để khuếch đại những trình trường đoản cú mục tiêu khác nhau trong thuộc 1 mix phản nghịch ứng. Để thi công được bội phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi các cặp mồi áp dụng phải bao gồm cùng ánh sáng bắt cặp và những cặp mồi này cũng ko được bắt cặp cùng với nhau xuất xắc bắt cặp chéo cánh lẫn nhau. Ngoài ra, cũng phải bảo vệ độ tinh tế Multiplex PCR tương tự với Simplex PCR, vấn đề đó rất khó xảy ra nên thông thường multiplex PCR được áp dụng ở các tế bào nuôi cấy vì lúc này số lượng trình tự đích đủ khủng sẽ không yên cầu quá hà khắc về độ nhạy.

Xem thêm: Cách Lần Chuỗi Lòng Thương Xót Chúa, Cách Lần Hạt Lòng Thương Xót Chúa Giêsu


*
Hình 4. Sơ đồ gia dụng một tiến trình Nested PCR

3) PCR tổ (Nested PCR): thực hiện 2 cặp mồi, cặp mồi bên ngoài (outer primer) và cặp mồi bên phía trong (nested primer). Cặp mồi bên ngoài sẽ thâm nhập PCR lần 1 trước để gia công tăng con số DNA đựng trình từ đích, tiếp theo là cặp mồi phía bên trong sẽ gia nhập PCR lần 2 nhằm phát hiện tại trình từ đích (Hình 4). Kỹ thuật này thực hiện khi cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích (nested primer) tất cả độ nhạy bén kém.

4) RT-PCR: Là các bước sử dụng khi trình trường đoản cú đích là RNA, hôm nay cần một bước áp dụng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA trước lúc PCR, tiến trình này điện thoại tư vấn là tiến trình RT. Nghệ thuật RT-PCR gồm 2 một số loại (Hình 5):